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聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理

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  聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和少量的交联剂在催化剂和加速剂的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶,经常在我们生活中扮演着重要角色,有些用户不太理解它的工作性质,那么今天咱们就来说一下它电泳分离蛋白质 的原理,方便大家更好地理解它的含义,并学会使用。
  (1)分子效应:聚丙烯酰胺凝胶对样品分子的筛选效应(分子筛效应)电场中,颗粒小、呈球形的样品分子泳动速度快;颗粒大、形状不规则的分子通过凝胶空洞时受到的阻力大,泳动慢。
  (2)阻力影响:不连续系统对样品的浓缩效应 凝胶层的不连续性:不连续系统的凝胶包括浓缩胶和分离胶。浓缩胶的孔径大,分离胶的孔径小。在电场的作用下,蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小,移动快。而在小孔 胶中泳动时遇到的阻力大,移动慢。因此,在两层凝胶的交界处,由于聚丙烯酰胺凝胶孔径的不连续性使样品迁移受 阻而压缩成很窄的区带。 缓冲液离子成分和pH的不连续性:在两层凝胶中均有Tris和HCl。Tris的作用是维持溶液的 电中性及pH。HCl在一定pH条件下易解离出Cl- ,它在电场中迁移率大,走在最前面,故称为快离子或前导离子。电 极缓冲液中的甘氨酸在pH8.3的缓冲液中解离度很小,仅为0.1-1%,因而在电场中迁移率很小,称为慢离子或尾随离 子。血清中,大多数蛋白质pI在5.0左右,在pH8.3或6.7时均带负电荷,在电场中均移向正极,其可用迁移率介于快 慢离子之间,于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处,被浓缩成极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时,甘氨酸解 离度增加,其迁移率程度超过蛋白质,因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大, 被留在后面,然后分离成多个区带。此外,电泳体系中电位梯度的不连续性对样品的浓缩和迁移也具有一定作用。
  (3)电荷效应:在分离胶中,各种血清蛋白所带静电荷不同,而有不同的迁移率。 聚丙烯酰胺凝胶表面电荷多,则迁移快,反之则慢。因此各种蛋白质按照电荷多少、分子量大小及分子形状以一定顺序排成一个个区带。不连续 PAGE所具有的分子筛效应、浓缩效应和电荷效应大大提高了它的分辨率。电泳后蛋白质染色目前常用的是考马斯亮 蓝法,其比氨基黑染色法灵敏度高,可以进行定量扫描,比银染法简便。
  通过以上文章的分享,大家想必会对聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理有了一些认识,它主要是依靠分胶,产生不同的迁徙率,这样染色会更方便,希望本次文章会对大家有所帮助。